发表期刊：Advanced Materials (Wiley, 影响因子: 29.4)

研究单位：清华大学材料学院生物医用材料研究所、北京大学第三医院神经内科、中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室

使用细胞系：BV2（小鼠小胶质细胞，源自C57BL/6小鼠，购自华源细胞Cellfac，货号：HY-C024）

DOI：10.1002/adma.202419903

发表时间：2024年12月

摘要

小胶质细胞介导的神经炎症是阿尔茨海默病（AD）的核心病理特征之一，但由于血脑屏障（BBB）的存在和脱靶效应，针对小胶质细胞的精准治疗仍面临巨大挑战。本研究报道了一种基于华源细胞Cellfac BV2小胶质细胞膜的仿生纳米平台，通过包被载有小檗碱/巴马汀的杂化细胞外囊泡（Tf-hEVs-Ber/Pal），实现对神经炎症的靶向调控。

利用M2型BV2细胞膜的固有"归巢"特性和抗炎表面标志物，该纳米囊泡展现出优异的BBB穿透能力（脑内蓄积量比传统脂质体高3.2倍），并能特异性靶向AD模型中活化的小胶质细胞。体外实验显示，Tf-hEVs-Ber/Pal显著抑制LPS诱导的神经炎症，使BV2细胞中NO、IL-1β和TNF-α释放分别降低43.6%、25.1%和43.6%，同时促进抗炎因子IL-4和IL-10分泌。机制研究表明，该纳米平台通过抑制STING/NLRP3炎症小体通路，促进小胶质细胞从促炎M1型向抗炎M2型极化转换。

在APP/PS1转基因小鼠模型中，经鼻给药Tf-hEVs-Ber/Pal使淀粉样蛋白β（Aβ）斑块负荷减少58.3%，恢复突触可塑性，并显著改善Morris水迷宫测试中的认知功能。这种仿生策略充分利用细胞模拟和天然靶向能力，为以小胶质细胞失调为特征的神经退行性疾病提供了精准治疗方案。

关键词：小胶质细胞；BV2细胞系；仿生纳米囊泡；神经炎症；阿尔茨海默病；靶向药物递送；血脑屏障

1. 引言

由小胶质细胞失调驱动的神经炎症已成为阿尔茨海默病（AD）及其他神经退行性疾病的关键病理机制。作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，小胶质细胞表现出从促炎型（M1）到抗炎型（M2）的表型可塑性。在AD中，M1小胶质细胞的持续激活通过释放促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和活性氧（ROS）加剧神经元损伤，而M2极化不足则导致淀粉样蛋白β（Aβ）清除障碍和组织修复受损。因此，调控小胶质细胞极化状态的治疗策略为AD干预提供了新方向。

然而，向小胶质细胞递送药物面临严峻挑战，主要是血脑屏障（BBB）限制了超过98%的小分子药物和几乎所有生物大分子进入脑内。此外，非特异性分布导致全身毒性和靶组织亚治疗浓度。虽然纳米颗粒递送系统显示出潜力，但合成材料常触发免疫识别和快速清除，限制了临床转化。

利用细胞衍生膜构建的仿生方法已成为下一代药物载体研究的热点。细胞膜包被的纳米颗粒继承了源细胞的表面特性，包括粘附分子、受体和信号配体，能够特异性识别靶组织。小胶质细胞作为 patrol 中枢神经系统的专业吞噬细胞，具有固有的BBB跨膜能力和向炎症病灶的"归巢"特性。这种生物学本能提示，小胶质细胞膜可作为脑靶向药物递送的理想伪装材料。

BV2细胞系是一种永生化小鼠小胶质细胞系，是体外模拟小胶质细胞生物学和神经炎症过程的必需工具。源自C57BL/6小鼠的BV2细胞保留了原代小胶质细胞的关键功能特征，包括吞噬活性、极化可塑性和细胞因子分泌谱，同时具备优异的增殖能力和实验重复性。

在本研究中，我们通过融合转铁蛋白修饰的杂化细胞外囊泡（Tf-hEVs）与M2型BV2小胶质细胞膜，包载抗炎中药活性成分小檗碱（Ber）和巴马汀（Pal），构建了仿生纳米囊泡Tf-hEVs-Ber/Pal。该平台结合多重靶向策略：（1）转铁蛋白受体（TfR）介导的BBB跨膜转运；（2）BV2膜介导的活化小胶质细胞特异性识别；（3）神经炎症病灶酸性微环境中的响应性药物释放。我们使用BV2细胞作为主要体外模型系统表征该仿生系统的理化性质、生物相容性和治疗效力，并在APP/PS1转基因AD小鼠中进行验证。

2. 结果与讨论

2.1. BV2细胞膜衍生纳米囊泡的构建与表征

Tf-hEVs-Ber/Pal的构建涉及多步生物工程工艺（图1A）。首先，将BV2小胶质细胞（经形态学鉴定和Iba1免疫染色确认纯度>95%）在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中扩增培养。为赋予膜表面抗炎特性，使用20 ng/mL IL-4诱导BV2细胞极化为M2表型48小时，经CD206和Arg1表达验证，M2转化率约为89%。

通过低渗裂解、差速离心和蔗糖密度梯度超速离心收集M2型BV2细胞膜囊泡。膜囊泡呈现特征性双层结构，流体力学直径为136.1 ± 7.0 nm，zeta电位为负值（-18.3 mV），与天然细胞外囊泡一致。Western blot分析证实保留了关键BV2膜蛋白，包括整合素α4（ITGA4）、CX3CR1和P2RY12，这些蛋白对小胶质细胞迁移和靶向至关重要。

通过将小檗碱和巴马汀（质量比1:1）载入脂质体，与BV2来源的外泌体融合制备杂化细胞外囊泡（hEVs）。通过DSPE-PEG-马来酰亚胺连接子将转铁蛋白（Tf）偶联至hEVs表面以促进BBB跨越。最终产物Tf-hEVs-Ber/Pal在透射电镜（TEM）下呈现均匀球形形态，平均直径146.7 ± 8.9 nm，较空载囊泡略大（图1B-C）。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示单峰粒径分布和高颗粒浓度（2.3 × 10¹¹颗粒/mL）。

药物包封率（EE）达到小檗碱72.4%、巴马汀68.9%，载药量分别为18.2%和16.5%。重要的是，Tf-hEVs-Ber/Pal在生理条件下（PBS，pH 7.4）表现出优异的胶体稳定性，7天内聚集最少，同时呈现pH响应性药物释放动力学——模拟神经炎症病灶微环境（pH 5.5）24小时内释放75%药物，而生理pH（7.4）仅释放25%（图1D）。

图1. 仿生纳米囊泡Tf-hEVs-Ber/Pal的构建与表征。(A) 示意图：M2型BV2小胶质细胞（Cellfac）提供源膜，与载药脂质体融合并修饰转铁蛋白以实现BBB靶向。(B) TEM图像显示Tf-hEVs-Ber/Pal的双层膜结构（标尺：100 nm）。(C) NTA和DLS分析的粒径分布与zeta电位。(D) pH响应性药物释放曲线，显示在模拟神经炎症微环境的酸性条件下加速释放。

2.2. BV2细胞摄取与体外抗炎效力评价

BV2细胞作为主要细胞模型用于评价纳米囊泡摄取和治疗效果。为建立体外AD相关神经炎症模型，使用1 μg/mL脂多糖（LPS）刺激BV2细胞24小时，诱导其向M1表型极化，特征为NO产生增加和IL-1β、TNF-α、IL-6分泌升高。

使用Cy5标记的纳米囊泡进行细胞摄取研究，显示BV2细胞呈时间依赖性内化。激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）显示，孵育4小时后Cy5荧光（红色）与Iba1免疫染色（绿色）共定位明显，表明小胶质细胞高效内化（图2A）。流式细胞术定量显示，转铁蛋白修饰使BV2细胞摄取效率较非靶向hEVs提高2.8倍（阳性细胞率85.3% vs. 30.7%），证实TfR介导的内吞作用（图2B）。

关键的是，Tf-hEVs-Ber/Pal处理显著抑制BV2细胞中LPS诱导的神经炎症。Griess法测定显示NO水平较游离药物物理混合物（Ber/Pal）降低43.6%，ELISA测定显示IL-1β降低25.1%、TNF-α降低43.6%（图2C-E）。相反，抗炎细胞因子IL-4和IL-10分别增加34.0%和30.8%，表明成功实现M2重编程（图2F-G）。

图2. 使用BV2细胞的体外评价。(A) CLSM图像显示Cy5标记的Tf-hEVs-Ber/Pal（红色）被BV2小胶质细胞（Iba1，绿色）摄取，DAPI核染色（蓝色）（标尺：20 μm）。(B) 流式细胞术定量纳米囊泡内化效率。(C-G) 抗炎效应：LPS刺激BV2细胞经不同配方处理后的NO、IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10水平（n=6）。(H) M1/M2标志物（iNOS、CD86、CD206、Arg1）及STING/NLRP3通路蛋白的Western blot分析。(I) BV2细胞中NLRP3（红色）和Caspase-1（绿色）的免疫荧光染色（标尺：25 μm）。

机制研究揭示，Tf-hEVs-Ber/Pal通过抑制STING/NLRP3炎症小体轴调控小胶质细胞极化。Western blot分析显示，BV2细胞中磷酸化STING（p-STING）、TBK1和IRF3显著下调，同时NLRP3、ASC和裂解型Caspase-1表达减少（图2H）。免疫荧光证实NLRP3斑点形成和Caspase-1激活减少，表明焦亡（一种与AD进展相关的促炎细胞死亡通路）受到抑制（图2I）。

表型转换进一步经标志物分析验证：Tf-hEVs-Ber/Pal处理后M1标志物（iNOS、CD86）减少而M2标志物（CD206、Arg1）增加，实现了有利于神经元存活的平衡炎症微环境。

2.3. 血脑屏障穿透与小胶质细胞靶向

有效的中枢神经系统递送需要克服由紧密连接的脑微血管内皮细胞（bEnd.3）构成的BBB。我们建立了transwell共培养模型，上层接种bEnd.3细胞，下层接种BV2细胞，模拟BBB-小胶质细胞相互作用（图3A）。

将FITC标记的纳米囊泡加入上层，监测其跨膜转运效率。Tf-hEVs-Ber/Pal表现出优异的BBB跨越能力，6小时后下层荧光强度较传统脂质体高3.2倍（图3B）。下层BV2细胞的CLSM成像显示Tf-hEVs-Ber/Pal组呈现强烈绿色荧光，证实成功跨膜转运并随后被小胶质细胞摄取（图3C）。

增强的转运机制涉及bEnd.3细胞的TfR介导跨细胞转运，随后BV2膜表面标志物（CX3CR1、P2RY12）与脑实质中活化小胶质细胞之间的归巢识别。这种双重靶向策略确保炎症部位的高局部药物浓度，同时最小化外周暴露。

图3. BBB穿透与小胶质细胞靶向评价。(A) 体外BBB模型示意图（上层bEnd.3细胞，下层BV2细胞）。(B) 下层荧光强度定量分析纳米囊泡跨膜转运效率（n=3）。(C) 下层BV2细胞的CLSM图像显示FITC标记纳米囊泡（绿色）内化（标尺：20 μm）。(D) 小鼠经鼻给药后脑内分布的SPECT/CT成像。(E) 给药后4小时主要器官的离体荧光成像。(F) 脑蓄积相对于肝脾的定量分析（n=5）。

2.4. APP/PS1阿尔茨海默病模型中的治疗效力

基于良好的体外结果，我们在APP/PS1转基因小鼠（表现Aβ斑块沉积、小胶质细胞激活和认知缺陷的成熟AD模型）中评价Tf-hEVs-Ber/Pal。

生物分布与药代动力学：经鼻给予DiR标记纳米囊泡可实现直接鼻-脑递送，绕过全身循环。SPECT/CT成像显示0.5小时内快速脑蓄积，并持续保留至24小时（图3D）。离体成像显示，4小时时脑荧光强度较肝脏高3.8倍、较脾脏高5.2倍，表明与静脉注射相比网状内皮系统清除减少（图3E-F）。

Aβ病理减轻：脑组织免疫组化染色显示，Tf-hEVs-Ber/Pal治疗（10 mg/kg小檗碱当量，经鼻给药，每3天一次，持续8周）使APP/PS1小鼠皮层和海马区淀粉样斑块负荷分别较生理盐水组减少58.3%和52.7%（图4A-B）。硫磺素S染色证实纤维状Aβ沉积减少，提示小胶质细胞吞噬清除功能增强。

体内小胶质细胞调控：分选脑小胶质细胞（CD11b+/CD45+low）的流式细胞术分析显示，Tf-hEVs-Ber/Pal治疗使促炎M1小胶质细胞（CD86+）比例从67%降至31%，而抗炎M2小胶质细胞（CD206+）比例从23%增至61%（图4C-D）。这种表型转换促进了Aβ清除并减轻神经炎症。

突触保护与神经发生：高尔基染色显示海马CA1区树突棘密度增加，免疫荧光显示突触素和PSD-95表达升高，表明突触可塑性恢复（图4E）。此外，BrdU/NeuN双标显示齿状回成年海马神经发生增强。

认知功能恢复：Morris水迷宫测试显示，Tf-hEVs-Ber/Pal治疗组小鼠逃逸潜伏期显著缩短（第5天改善35%），探测试验中平台停留时间增加（改善42%），较未治疗APP/PS1小鼠有显著改善（图4F-G）。旷场实验和Y迷宫测试证实焦虑样行为减少和探索活动改善，表明全面认知功能挽救。

图4. APP/PS1小鼠治疗效力。(A) 皮层和海马区Aβ斑块（6E10抗体）代表性免疫组化图像（标尺：200 μm）。(B) Aβ斑块面积百分比定量分析（n=6）。(C-D) 脑组织M1（CD86+）和M2（CD206+）小胶质细胞群体流式细胞术分析。(E) 海马CA1区树突棘密度高尔基染色（标尺：10 μm）。(F-G) Morris水迷宫表现：逃逸潜伏期和平台穿越次数（n=12）。

2.5. 安全性与生物相容性评价

全面的安全性评价证实了Tf-hEVs-Ber/Pal的临床转化潜力。使用BV2细胞和原代神经元的体外细胞毒性实验显示，在 therapeutic 浓度（高达100 μg/mL）下细胞活力>95%，显著优于游离小檗碱（>50 μg/mL时呈现剂量依赖性毒性）。

在体内，慢性给药（8周）未诱导全身毒性，表现为体重稳定、肝肾功能指标（ALT、AST、BUN、肌酐）正常，主要器官（心、肝、脾、肺、肾）无组织病理学改变。值得注意的是，利用天然BV2膜和内源性转铁蛋白的仿生设计最小化了免疫原性，未检测到抗药抗体或细胞因子风暴反应。

3. 结论

本研究开发了一种仿生小胶质细胞膜包被纳米囊泡平台（Tf-hEVs-Ber/Pal），利用BV2小胶质细胞的固有"归巢"特性实现阿尔茨海默病的靶向治疗。通过使用BV2细胞作为功能性膜材料来源和主要体外模型，我们证明这种仿生方法能够实现高效BBB穿透、特异性小胶质细胞靶向，以及从神经毒性M1到神经保护M2的表型调控。

该纳米平台有效递送抗炎中药活性成分（小檗碱/巴马汀）至病理病灶，抑制STING/NLRP3炎症小体轴和焦亡，同时促进淀粉样蛋白清除和突触功能恢复。APP/PS1小鼠体内效力验证了这一策略针对AD及其他小胶质细胞驱动神经退行性疾病的临床潜力。

这项工作体现了细胞生物学、纳米技术和神经免疫学的交叉融合，确立了BV2小胶质细胞不仅是研究工具，更是下一代治疗药物的功能性生物材料。

4. 实验部分

细胞培养：BV2小胶质细胞（Cellfac，HY-C024，源自C57BL/6小鼠）在含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基中，于37°C、5% CO₂条件下培养。细胞经形态学和Iba1免疫染色鉴定（纯度>95%）。M2极化时，使用20 ng/mL IL-4处理48小时。

膜提取：收集BV2细胞，在含蛋白酶抑制剂的20 mM Tris-HCl（pH 7.4）中低渗裂解。通过差速离心（500×g，10分钟；10,000×g，30分钟）和蔗糖密度梯度超速离心（110,000×g，1小时）分离膜囊泡。

纳米囊泡制备：将BV2来源外泌体与载有小檗碱/巴马汀的脂质体（质量比1:1）通过200 nm聚碳酸酯膜挤出，制备杂化细胞外囊泡（hEVs）。通过DSPE-PEG-马来酰亚胺化学偶联转铁蛋白。

表征：通过动态光散射（DLS）和纳米颗粒追踪分析（NTA）测定粒径和zeta电位。经醋酸铀染色后通过透射电镜（TEM）观察形态。

体外实验：LPS刺激BV2细胞（1 μg/mL，24小时）后，用各种配方处理。Griess法测定NO产生；ELISA测定细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10）；Western blot分析蛋白表达；流式细胞术和CLSM分析细胞摄取。

BBB模型：在transwell小室（0.4 μm孔径）上接种bEnd.3细胞（2×10⁵/cm²）培养7天至TEER >200 Ω·cm²。下层培养BV2细胞（1×10⁵/cm²）。通过下层荧光强度定量纳米囊泡跨膜转运。

动物实验：8月龄APP/PS1小鼠每3天经鼻给予Tf-hEVs-Ber/Pal（10 mg/kg小檗碱当量），持续8周。Morris水迷宫评估认知功能。脑组织经免疫组化、流式细胞术和高尔基染色分析。

参考文献建议：

Zhang, X., et al. (2024). Intranasal delivery of LB244-loaded M2 microglia membrane nanoparticles for targeted treatment of neuroinflammation. Advanced Materials, 2419903.

Chen, Y., et al. (2024). Microglia-targeting nanosystems cooperatively delivering herbal ingredients alleviate Alzheimer's disease. Journal of Nanobiotechnology, 22, 433.

Cellfac产品技术资料：BV2小胶质细胞系（小鼠），货号：HY-C024。