资源中心
细胞系溯源与生物学特性
RAW 264.7细胞源自Abelson鼠科白血病病毒诱导的BALB/c小鼠肿瘤组织，是免疫学领域广泛认可的小鼠单核巨噬细胞系，具有典型的成熟巨噬细胞表型，呈悬浮-贴壁双重生长特性。该细胞系保留功能性Toll样受体4（TLR4）及完整的炎症信号转导通路，可高效响应脂多糖（LPS）刺激，产生一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症介质，是研究巨噬细胞极化、异物反应（Foreign Body Response, FBR）及生物材料免疫相容性的标准模型。
NIH-3T3细胞（National Institutes of Health/3-day transfer, inoculum 3×10⁵ cells）源于瑞士小鼠胚胎成纤维细胞，经长期传代建系，呈现成纤维细胞样形态，贴壁生长，具有旺盛的细胞外基质（ECM）合成能力。该细胞系表达波形蛋白（Vimentin）、I型胶原（Collagen I）及纤连蛋白（Fibronectin），是研究纤维化进程、伤口愈合及生物材料细胞相容性的经典模型。
两种细胞系的种属一致性（均源于小鼠）及功能互补性（免疫细胞与基质细胞）使其成为构建体外共培养体系的理想组合，广泛应用于生物材料评估、慢性炎症机制解析及组织工程支架优化研究。
共培养体系的构建策略与应用价值
1. 异物反应（FBR）与生物材料免疫评估
根据最新Advanced Science研究，RAW 264.7与NIH-3T3共培养模型可有效模拟植入物-组织界面的免疫微环境。当生物材料（如医用级硅胶、组织工程支架）植入体内后，首先吸附血清蛋白与细胞衍生蛋白（来自损伤组织或成纤维细胞），形成蛋白冠（Protein Corona）。这些吸附蛋白可作为损伤相关分子模式（DAMPs）激活巨噬细胞，启动炎症级联反应。实验设计策略：
● 直接接触共培养：将RAW 264.7细胞接种于已包被NIH-3T3细胞裂解液或条件培养基的生物材料表面，评估细胞衍生蛋白对巨噬细胞激活的影响；
● 间接接触（Transwell系统）：利用0.4 μm孔径的聚碳酸酯膜分隔上下室，RAW 264.7接种于上室，NIH-3T3（或分化后的3T3-L1脂肪细胞）生长于下室，研究炎症介质（如NO、IL-6）与代谢产物（如瘦素Leptin）的跨膜扩散及功能互作；
● 条件培养基交换：收集LPS刺激的RAW 264.7上清（含M1型炎症因子）处理NIH-3T3，模拟慢性炎症微环境对成纤维细胞胶原合成及分化（肌成纤维细胞转分化）的影响。
2. 组织纤维化体外模型
RAW 264.7与NIH-3T3共培养体系是研究炎症驱动纤维化的理想模型。在高糖（5400 μg/mL）联合LPS（0.25 μg/mL）条件下，RAW 264.7向M1型促炎表型极化，释放TGF-β、IL-1β等纤维化关键因子，诱导NIH-3T3向肌成纤维细胞转化，上调α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及I型胶原表达。可参考的最新研究应用：
● 树突状纳米滑涂层（DNSC）评估：Advanced Science研究表明，将RAW 264.7与NIH-3T3与新型生物材料（如滑涂层修饰的纳米纤维支架）共培养，可系统评估材料的细胞毒性、巨噬细胞极化诱导能力及成纤维细胞黏附/增殖特性；
● 超疏水表面（SHS）球体共培养：利用超疏水表面促进两种细胞自组装形成3D共培养球体，模拟实体瘤微环境中巨噬细胞与癌相关成纤维细胞（CAFs）的交互作用。
3. 代谢性疾病与肥胖炎症研究
通过引入3T3-L1脂肪细胞分化体系，可构建RAW 264.7-3T3-L1共培养模型，模拟肥胖相关的慢性低度炎症状态。RAW 264.7经LPS激活后，通过分泌TNF-α、IL-6诱导脂肪细胞胰岛素抵抗，降低葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）及胰岛素受体底物-2（IRS-2）表达，同时脂肪细胞分泌的瘦素（Leptin）可进一步促进巨噬细胞M1极化，形成炎症恶性循环。
细胞生物学特性与培养要点
1. RAW 264.7细胞培养规范
● 形态特征：未活化状态下呈圆形或阿米巴样，直径12-15 μm，核质比高；LPS刺激后延伸伪足，呈现典型巨噬细胞铺展形态；
● 倍增时间：约12-18小时，传代比例1:3至1:6，建议每2-3天传代，维持细胞密度于70-80%融合度，避免过度融合导致的自发活化；
● 消化方法：推荐使用无酶细胞解离液或 gentle scraping（细胞刮），避免胰酶过度消化损伤细胞膜受体；
● 冻存复苏：采用无血清冻存液（含10% DMSO），复苏后存活率>90%，建议实验使用P5-P20代细胞以保证炎症响应稳定性。
2. NIH-3T3细胞培养规范
● 形态特征：长梭形成纤维细胞样，呈平行排列或漩涡状生长，胞质丰富，核椭圆居中；
● 倍增时间：约20-24小时，传代比例1:10，建议使用DMEM高糖完全培养基（含10% FBS），在37°C、5% CO₂条件下培养；
● 接触抑制：具有典型的密度依赖性生长抑制特性，融合后停止增殖，适用于研究细胞-细胞接触信号；
● 传代建议：实验使用低于P15代细胞，避免长期培养导致的自发转化及核型异常。
3. 共培养实验关键技术参数
实验类型 | 细胞比例 | 培养体系 | 关键检测指标 | 培养时间 |
炎症-纤维化模型 | RAW 264.7:NIH-3T3 = 1:1 或 1:2 | DMEM + 10% FBS + LPS (0.25 μg/mL) + 高糖 | TGF-β mRNA、Collagen I分泌、α-SMA表达 | 24-48 h |
Transwell互作研究 | 上室RAW 264.7 (8×10⁵)，下室NIH-3T3 (1×10⁶) | 无血清DMEM（含ITS） | NO（Griess法）、IL-6、Leptin（ELISA） | 24 h |
生物材料毒性评估 | 各5×10⁴ cells/cm² | 材料浸提液或直接接触 | Live/Dead染色（Calcein-AM/PI）、CCK-8代谢活性 | 1-3天 |
3D球体共培养 | 初始密度2×10⁶ cells/mL，比例可调 | 低黏附U型底板或超疏水表面 | 球体圆度、直径、内部细胞活力 | 24-48 h |
CellFac细胞产品技术规格与质控标准
1. 遗传学与身份认证：
● RAW 264.7：小鼠源9个STR位点鉴定（1-1, 1-2, 2-1, 3, 4, 5, 6, 7, 8），确认BALB/c背景，排除人源细胞交叉污染；
● NIH-3T3：小鼠源STR鉴定，确认瑞士小鼠胚胎成纤维细胞遗传特征。
2. 微生物学与安全性：
● 支原体（PCR法+Hoechst 33258染色）、细菌、真菌、酵母均为阴性；
● 鼠源病毒（MHV, MVM, MPV, MAd等）筛查阴性。
3. 细胞性能指标：
● RAW 264.7：LPS响应验证（1 μg/mL LPS刺激24 h，NO产量>30 μM，TNF-α分泌显著上调）；
● NIH-3T3：接触抑制验证、血清依赖性增殖验证；
● 复苏后存活率≥95%，冻存液为无血清细胞冻存液。
4. 发货方式：
● 复苏发货：T25培养瓶，细胞处于对数生长期（密度70-80%），48小时恒温运输；
● 冻存发货：1 mL冻存管，1×10⁶细胞/支，干冰运输，液氮长期保存建议。
Advanced Science最新研究应用实例
根据Advanced Science（DOI: 10.1002/advs.202521672）最新发表的研究，树突状纳米基滑涂层（DNSC-MC）的生物相容性评估采用了RAW 264.7与NIH-3T3共培养策略：
1. 细胞活力评价：将两种细胞分别与DNSC-MC材料浸提液共培养1-3天，采用Live/Dead荧光染色（Calcein-AM标记活细胞，PI标记死细胞）及CCK-8代谢活性检测，确认材料细胞毒性低于ISO 10993-5标准（细胞活力>80%）；
2. 巨噬细胞极化分析：通过免疫荧光检测RAW 264.7的iNOS（M1标志）与CD206（M2标志）表达，评估材料表面特性对免疫表型的调控作用；
3. 成纤维细胞功能评估：观察NIH-3T3在材料表面的黏附形态（F-actin细胞骨架染色）、增殖曲线及胶原分泌能力，验证材料支持软组织整合的潜力。
该研究证实，RAW 264.7与NIH-3T3联合应用可为生物材料的多维度生物相容性评价提供可靠的体外数据，有效桥接材料科学、免疫学与组织工程学的交叉研究。
结语：RAW 264.7与NIH-3T3细胞共培养体系通过模拟免疫细胞-基质细胞的交互对话，为生物材料免疫相容性评估、慢性炎症机制解析及组织纤维化研究提供了标准化、可重复的体外模型。CellFac致力于提供经严格质控、遗传背景清晰的细胞资源与配套培养体系，助力您的生物材料研究与转化医学开发取得突破性进展。
